自2012 年 10 月開始，分子生物學家 Katsuhiko Hayashi 就陸陸續續收到了許多夫妻的郵件，這些夫妻大多人到中年，仍然在為了一件事情焦急：要一個孩子。其中有一位英國的更年期婦女，希望到他位于日本京都大學的實驗室，在他的幫助下懷上孩子，她寫道：“這是我唯一的愿望。”

       這些請求開始于 Hayashi 一篇文章的發表——他原以為只有發育生物學家才會對他的實驗結果感興趣。在體外條件下，利用小鼠的皮膚細胞創造可以發育成精子和卵子的原始生殖細胞（ PGCs ）。為了證明這些實驗室培養的原始生殖細胞與自然發育而成的原始生殖細胞類似，他利用它們生成了卵子，進而創造小鼠生命。他表示，這個創造出來的小鼠生命 僅僅是他研究的一個“副產品”，他的研究將意味著更多——利用不孕婦女的皮膚細胞為她們提供可受精的卵細胞。與此同時他還提出，男性的皮膚細胞也可以用來 創造卵子，同樣，女性的皮膚細胞也可以生成精子。（事實上，研究結果發表后，許多同性戀發郵件給 Hayashi ，索要更多的信息。）

       盡管這是一項創新研究，但是公眾的廣泛關注還是令 Hayashi 和他的教授 Mitinori Saitou 感到非常驚訝。他們花了十多年不斷挖掘哺乳動物配子產生的微妙細節，然后在體外條件下重新創建該過程——一切都是為了科研，而非醫療。現在他們的方法使研究人員能夠創建無限的原始生殖細胞，這種在以前很難獲得的珍貴細胞的正常供應有助于推動哺乳動物生殖研究。

       但是，當他們將這個科學挑戰自小鼠到猴子，再到人類推進時，這一過程被公眾定義為治療不孕不育的過程，于是相關的道德爭議隨之出現。“毫無疑問，他們在小鼠身上給這一領域帶來了重大的改變，” 洛杉磯加州大學的生育專家 Amander Clark 說，“但是，在這項技術展示它的實用性之前，我們必須討論一下使用這種方式創造配子的倫理問題。”

回到最初

       在小鼠體內，胚胎發育一周后，便出現約 40 個左右的原始生殖細胞。這個小小的細胞團進而在雌性小鼠體內形成成千上萬的卵細胞，在雄性小鼠體內每天都能生成幾百萬個精細胞，并能夠遺傳小鼠的全套遺傳信息。 Saitou 想要了解在這些細胞發育過程中受到了那些信號的控制。

       在過去的十年中， Saitou 已經通過辛苦研究確定了幾個基因——包括 Stella, Blimp1 和 Prdm14 ——這些基因的某種組合在某些時候對于 PGCs 的發育起到了至關重要的作用。利用這些基因作為標記，可以從其他細胞中篩選原始生殖細胞以觀察這些細胞的變化。2009 年，在日本神戶的 RIKEN 發育生物學中心，他發現，當培養條件適當時，在精確的時間加入骨形態發生蛋白4（ BMP4 ），可以胚胎干細胞轉化為原始生殖細胞的。為了驗證這一發現，他向胚胎干細胞提供高濃度的 BMP4 ，結果顯示，幾乎所有的胚胎干細胞都變成了 PGCs 。他和科學家們都預計這一過程非常復雜。

人造小鼠生殖細胞產生小鼠胚胎的過程

       Saitou 的方法嚴格遵循了自然過程，這與其他從事類似研究的人形成了鮮明的對比，以色列魏茨曼科學研究所的干細胞專家 Jacob Hanna 說。許多科學家嘗試通過信號分子轟擊干細胞在體外創造特定類型的細胞，然后篩選細胞混合物得到他們想要的細胞。但是他們忽略了這些細胞的自然形成過程和這些人造細胞與自然形成細胞的相似程度。 Saitou 找出了形成生殖細胞所需的條件，去除多余的信號干擾并將每個過程的時間精確控制，給他的同事們留下了深刻的印象。英國謝菲爾德大學的干細胞生物學家 Harry Moore 將這種生殖細胞發育的精確重現視為一場“勝利”。

       到了 2009 年， Saitou 在小鼠生殖細胞出現之前從外胚層取了一些細胞，這成了研究的起點。但是想要真正掌握這個過程中， Saitou 希望從細胞培養開始。

       當時正值 Hayashi 從英國劍橋大學回到日本，和 Saitou 一樣， Hayashi 在該領域先驅 Azim Surani 英國的實驗室里完成了4年的研究。 Surani 盛贊這兩位科學家說，他們的“氣質、風格和解決問題的方法能夠相互補充”。 Saitou “處理事情時很有系統性、完成目標一心一意”，而 Hayashi “工作時更有直覺、視角更廣闊、處理問題方法相對更加寬松”，他說。“他們確實形成了一個非常強大的團隊。”

       Hayashi 加入了 Saitou 京都大學的團隊，他很快就發現，那里不同于劍橋。在京都大學， Hayashi 用在理論討論上的時間比曾經少得多，而更多的時間都花在實驗上。他說“在日本，我們只管‘做’，這有時是非常低效的，但有時又醞釀著巨大的成功”。

       Hayashi 同樣以外胚層細胞作為起點，但與 Saitou 不同的是，他試圖培養一個能夠產生原始生殖細胞的穩定細胞系。可惜這種方法沒有奏效。 Hayashi 借鑒其他研究結果——一個關鍵調控分子（activin A）和生長因子（bFGF）可以將培養的早期胚胎干細胞轉化成類似于外胚層細胞的細胞類型。這引發了 Hayashi 將這兩個因素結合起來的想法，誘導胚胎干細胞分化為外胚層，然后采用 Saitou 之前的方法把這些細胞成為的 PGCs 。通過這種新的方法，他最終獲得了成功。

       為了證明這些人造的原始生殖細胞是真實的拷貝，他們必須證明這些細胞可以進一步發育成精子和卵子。這一進程是非常復雜和難以理解的。所以研究小組將這一工作留給了自然—— Hayashi 將 PGCs 植入無法產生精子的小鼠的睪丸，觀察這些細胞是否會發育。 Saitou 認為，這是可行的，但還是感到有些擔憂。當實驗進行到第 3 或 4 只小鼠時，他們發現小鼠的輸精管里充滿了精子。“這一切都發生得恰如其分，我知道他們會產生幼仔，” Hayashi 說。研究小組將這些精子注入卵細胞中并植入雌性小鼠的胚胎，結果產生了大量的雌性和雄性后代。

       他們利用誘導多能干細胞（iPS）進行反復的實驗，成熟的細胞被重新編程為胚胎狀態。此外，精子被用于生產幼仔，證明它們具有基本功能——這是干細胞分化領域的罕見成就。 Clark 說：“這是整個多能性干細胞研究領域里在培養皿中生成全功能細胞類型少有的成功案例之一。”

       他們預計形成卵細胞更復雜，但是在去年， Hayashi 在體外條件下制作有正常著色的原始生殖細胞并轉入白化小鼠的卵巢，將產生的卵細胞體外受精后植入代孕。當透過幼崽半透明的眼瞼看到黑色的眼睛時，他知道這一切又成功了。

生殖細胞的回饋

       目前，許多研究人員已經能夠復制驗室培養原始生殖細胞的過程。人造原始生殖細胞特定用于表觀遺傳學研究：通過修飾 DNA 確定哪些基因表達。最常見的修飾就是為 DNA 堿基加上甲基，這些修飾在有些情況下，能夠反映生物所經歷的歷史過程。與其它類型的細胞類似，表觀遺傳標記改變了原始生殖細胞在胚胎發育過程中的命運，但 原始生殖細胞有個與眾不同的特點，就是當它們發育成精子和卵子后，表觀遺傳標記被擦除。這就允許細胞創建能夠形成任何類型細胞的受精卵。

       表觀遺傳微妙變化中出現錯誤將會導致不孕不育并出現器官故障，如如睪丸癌。 Surani 和 Hanna 的團隊已經利用人造原始生殖細胞研究不同酶在表觀遺傳調控中的作用，也許有一天，能夠解答表觀遺傳網絡如何參與疾病調控。

       事實上，體外產生的原始生殖細胞可以為研究提供數百萬個細胞，而不是供科學家研究了 40 個左右，這些細胞可以通過解剖早期胚胎獲得。 Hanna 說：“這是一個大問題，因為我們這里有這些稀有的原始生殖細胞正在經歷我們尚不了解的全基因組表觀遺傳變化。”“體外模型為科學家們提供了前所未有的方便，” Clark 表示認同。

臨床意義

       但是 Hayashi 和 Saitou 沒有辦法向乞求幫助的不孕夫妻提供幫助。在這種方法被運用在臨床之前，還有許多問題需要梳理。

       Saitou 和 Hayashi 發現，雖然運用他們的技術所產生的后代通常似乎是健康和大量的，但這些后代產生的原始生殖細胞并生不完全“正常”。 第二代原始生殖細胞產生的卵細胞往往是脆弱、畸形的，并且從支持它們生長的組織上脫離。當受精時，卵細胞內部會分為三組染色體，而不是正常的兩組，體外受精的成功率也只有正常原始生殖細胞的三分之一。哈佛醫學院從事表觀遺傳學研究的 Yi Zhang，使用 Saitou 的方法在研究中發現，體外受精過程中，人造的原始生殖細胞不能像自然狀態下產生的原始生殖細胞一樣，抹去它們的表觀遺傳標記。“我們必須要知道，這些都是 PGCs 的類似細胞，而不是真正的原始生殖細胞，”他說。

       此外，這項技術還存在兩個大的挑戰。首先是在不將 PGCs 放回睪丸或卵巢的前提下買入和使它們變成成熟的精子和卵子， Hayashi 目前正在試圖破解 PGCs 生成卵子或精子的生物信號，使人工培育條件下完成這一階段成為可能。

       但最可怕的挑戰是在人體重復上述所有的工作。該小組已經在利用 Saitou 找到的關鍵調控基因來調整人類的iPS細胞，但是 Saitou 和 Hayashi 都知道，人類的信息調控網絡不同于小鼠。此外， Saitou 有無數的小鼠胚胎進行解剖，但無法在人類胚胎進行相應的實驗步驟。幸運的是，他們得到了長達 5 年共 1.2 億日元的資助，每周可以獲得 20 個猴子胚胎。 Hayashi 表示如果一切順利的話，他們可以在5-10年內在猴子身上完成所有的工作。隨后經過一些小的調整，這種方法就可以用來生產人類原始生殖細胞。

       但是利用原始生殖細胞治療人類不孕不育仍將是一個巨大的跳躍，許多科學家對此持有相當謹慎的態度，這當然包括 Saitou 在內。iPS和胚胎干細胞在培養過程中常常會出現染色體異常、基因突變等現象。“如果在整個過程中出現一點差錯，都可能產生深遠的、多代的不良后果。” Moore 說。

       證明該技術在猴子實驗中時安全的，將打消人們的顧慮。但又有新的問題隨之而來，要有多少健康的猴子出生，才能證明這個方法是安全的？實驗需要觀察多少個猴子世代？

       最終，還是需要人類胚胎進行測試，而這一進程勢必會受到胚胎研究倫理問題的限制。近年來，新的非侵入性成像技術，將幫助醫生對胚胎質量的好壞進行精確排序。這種人造胚胎可以利用類似于正常的體外受精胚胎的植入方式進入母體。這些有可能在胚胎研究態度較為寬泛的地區實現。

       當技術準備完成，挑戰生殖的更大壯舉也是有可能實現的。舉例來說，人的皮膚細胞理論上可以被用來創造與伴侶精子配對的卵細胞，然后植入子宮孕育。但是存在 這樣的懷疑，有些事情似乎永遠無法實現——國際科學家協會的Hinxton團隊認為從男性XY細胞很難獲得卵細胞，同理，女性的XX細胞，也很難培養成為 精子。

       Saitou 用雄性小鼠iPS細胞制造出了精子，利用雌性小鼠制造出了卵細胞，他曾表示反過來也是可能的。如果是這樣的話，同一只小鼠產生的卵細胞和精子受精，就會產生，以前從未見過的東西：自交小鼠。 Hayashi 和 Saitou 都不愿意嘗試這個。“如果有充分的科研理由，我們只會在小鼠身上這么做，” Saitou 說。但眼下，他還沒有看到這樣的理由。

       這兩位科學家已經感受到病人和資金的壓力，這項技術可能是無法做試管嬰兒的婦女或者是無法產生精子或卵子的人的最后希望。 Hayashi 表示真正可行的不孕不育治療方案可能要在10年甚至50年的未來方能實現。“在我看來，那是很遙遠的事，我不想給人們不現實的希望，”他說。

       許多不孕不育患者只看到了最終的結果——小鼠實驗的成功——但卻忽略了多年艱苦細致的工作。 Hayashi 說，他們沒有意識到，人類胚胎與小鼠差異非常之大，從小鼠到人類就意味著這一切幾乎是從零開始。

原文檢索：

David Cyranoski. Stem cells: Egg engineers. Nature. 21 August 2013; doi:10.1038/500392a