供稿機構：漢氏聯合高等研究院南開大學博士后工作站
　　
　　作者：楊思俊博士、于淼英博士

　　衰老可能是每一個人一生都要面對的問題，從生物學角度來說，我們的DNA,RNA,細胞水平如何反應我們的衰老程度呢？這里面有哪些指標是和我們年齡密切相關的？通過這些指標的改善我們是否會實現延緩衰老呢？
　　
　　基于這些問題，本期細胞科技專欄，我們邀請了干細胞研究領域專家于淼英博士，和大家一起分享漢氏聯合在衰老相關領域的研究內容，我們總結翻譯了多篇文獻，從DNA、RNA、細胞三個層面解讀衰老的相關指標，為未來衰老指標體系的建立和診斷標準提供參考依據。
　　
　　不同的人生理衰老的速度有很大的不同，因此需要找到精確測量它的工具。生物體的每一個性狀都是隨年齡變化的，可以作為衰老的生物標記物，但并不是所有的生物標記物都具有信息量和診斷價值。本次專欄將綜述衰老的基本分子和細胞生物標記物，這些標記物被細分為不同的組別(可以是分子、信號級聯(或分子復合物)、細胞內結構或其功能)，這些標記物在衰老過程中會發生重大變化，可以為后期抗衰老效果的檢測起到一定的參考意義。
　　
　　The American Federation For Aging Research
　　
　　美國老齡化研究聯合會(The American Federation For Aging Research)關于衰老生物標記物的識別標準有四個內容，每個衰老的生物標記物都必須符合。這四個標準分別是：
　　
　　1、這個生物標記物可以預測衰老的速度。
　　
　　2、衰老生物標記物必須反映生理衰老的基本過程，而不能反映疾病的發病機制。
　　
　　3、它必須是可重復和非侵入性的，換句話說，對多次測試的人是無害的。
　　
　　4、它必須能在屬于不同類群的模型動物身上重現。

　　毫無疑問，上述生物標志物是一種理想的模型。然而，至少遠方的兩個要求必須得到滿足。隨著生物信息學、組學的發展，有科研人員嘗試用大數據的方式來解讀衰老標志物的大量數據庫，不幸的是，當進行了數千個維度(生物標志物價值的測量)的復雜研究數據分析時，不同數據的冗余給結果的分析和解釋帶來了很大的困難，即所謂的多維詛咒。為了方便分析，我們把衰老過程中分子生物標記物的多樣性根據遺傳信息轉導水平或“分子生物學中心法則”的不同而細分為幾類。
　　
　　1. 衰老的DNA相關生物標志物

　　端粒縮短被認為是最早描述的分子衰老生物標記物之一，端粒是包括位于染色體末端的核糖核蛋白的六聚體串聯重復復合體，由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性，每次DNA復制都會使端粒變短，但有一種名為端粒酶的酶可以重新合成丟失的端粒重復序列。該酶主要在永生化細胞和干細胞中有活性，但在體細胞中有活性被抑制。端粒在以某種方式激活端粒酶后會改變其長度。細胞中端粒的長度表明組織的復制狀態。利用增殖細胞中端粒磨損的組織特異性動態輪廓，可以預測預期壽命和老年率。
　　
　　有兩個與端粒相關的的衰老生物標志物被充分研究：血液白細胞端粒長度和端粒DNA損傷反應誘導的蛋白質。此外，3q26位點(Rs12696304)也被鑒定為衰老加速因子。它編碼TERC，一種人類端粒酶的核糖核成分。攜帶上述基因變異的個體與具有正常基因的個體的生物學年齡不同，根據端粒長度，這種差異相當于3-4年生物學年齡。
　　
　　與DNA相關的生物標記物是甲基化組譜，也被稱為表觀遺傳時鐘。由于其高精度，它可能是研究最深入的生物年齡標記，使用表觀遺傳學時鐘可以以3.5年的精度估計生物年齡；總共有353個CpG甲基化島，其中193個位點高度甲基化，與衰老呈正相關，160個島的低甲基化與衰老呈負相關。在生長個體中觀察到對數曲線(來自353CpG甲基化的信號)，之后“時鐘”的速度減慢，當成年開始時，該曲線變為線性。
　　
　　DNA甲基化并不是在衰老基因組中觀察到的唯一修飾，表觀遺傳生物標志物是多樣的，并且與組蛋白修飾相關，例如衰老相關的異染色質或組蛋白丟失，但是在衰老的背景下，染色質和組蛋白生物標志物知之甚少。衰老改變了CpG羥甲基化水平，這一過程尚未像DNA甲基化那樣得到深入研究，生物標記物僅用于肝活檢，并在人腦上進行了測試。
　　
　　線粒體DNA拷貝數也可作為為年齡的生物標記物。比如，隨著年齡的增長線粒體DNA的質量而降低，可以通過間接測量的線粒體基因組的值來反應(使用細胞色素c氧化酶(COX)mRNA的表達來表征)。此外，血漿中循環的無細胞線粒體和基因組DNA被認為是幾種疾病的診斷標記物，但在非老年人群(90歲以上)中，其碎裂程度，特別是低分子量部分，可用于預期壽命測量。
　　
　　2. 與RNA相關的衰老生物標志物

　　后基因組時代各類技術的發展給衰老生物標記物選擇的提供了新視角，Peters等人研究顯示了對血液樣本轉錄圖譜進行“轉錄年齡”測量的可能性，該研究使用了一個人數巨大數據庫(超過14,000名歐洲血統的人)數據集進行比較，其中差異表達基因(共1497個序列)被選為“轉錄組年齡”的指標。
　　
　　毫無疑問，轉錄圖譜是非常多樣化的，RNA的某些特定部分可能被用作衰老的生物標志物。比如非編碼RNA片段，其水平與年齡相關。在血漿中循環的miRNA組的短序列(小于23個堿基)首次與小鼠的衰老有關。MiR-21組與人和小鼠聽力損失以及炎癥有關。
　　
　　另外，循環的miRNAs作為生物標記物在健康和不健康的衰老軌跡中也有相關研究。比較了百歲老人組、他們的后代和具有典型衰老速度的人之間miRNA水平的變化。在百歲老人組中，miR-106a、miR-126、miR20a、miR-144、miR-18a隨年齡增長下調，與老年組相比，其他組miR-320d、miR-320b上調。Olivieri還檢測到老年人血漿中miR-21表達下調，而65歲以下人群中miR-21表達上調，并且，miR-363、miR-1974、miR-223、miR-148A、miR-148A對EBV病毒感染的永生化B細胞均有促進作用。Serna等測試了百歲老人與老年人和年輕人的單個核細胞，并研究了miR-21和miR-130a的上調對衰老的影響。
　　
　　在年老的供者血清中，Hooten等發現miR-151a-3p、miR-181a-5p、miR-1248水平下降。Meder等發現miR-34a-5p、miR-145-5p、miR-1284、miR-93-3p和miR-1262水平與年齡呈正相關。Amling等觀察到miR-126-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-142-3p、let-7a-5p隨年齡增長水平升高，miR-93-5p下調。
　　
　　還有一類，長非編碼(LNC)RNA是轉錄組的另一部分，被認為與衰老密切相關。“衰老的標志”分類中的每一個與衰老相關的過程都受到許多長的非編碼RNA的調控，因此lncRNA決定了年齡相關疾病中的基因表達模式，這些序列被認為是能量代謝和免疫反應的調節器，以及神經退化和增殖的調節器。例如，在人類中，MIR31HG或Meg3水平的升高與細胞衰老密切相關。
　　
　　3. 衰老的蛋白質組和代謝組學生物標志物。

　　衰老的基本蛋白質組學標志是在最早的蛋白質質譜工作中檢測到的。通過對健康對照組和不健康實驗組個體蛋白質組和代謝譜的比較，發現與衰老相關的蛋白質組和代謝組變化有很大差異。
　　
　　有幾種年齡相關的病理，如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏病，II型糖尿病，動脈粥樣硬化，心力衰竭，冠狀動脈疾病，它們都有自己的標志物，由于后四種疾病的高滲透率，對健康衰老生物標志物的搜索由于總代謝網絡的改變而變得非常復雜。Gregory等總結在蠕蟲、小鼠和人類上進行的大量代謝學和蛋白質組學實驗中獲得的數據，可以清楚地看出，代謝譜具有更強的可靠性，并且對衰老有更直接的反應，相反，在衰老模型中差異表達的蛋白質數量要少得多。
　　
　　4. 廣泛使用的衰老代謝生物標志物

　　代謝組本身是衰老的生物標志物，但代謝組學方法對于全科醫生、內科醫生或老年醫生等人的日常使用來說過于復雜和時間成本過高，我們整理了幾個也在代謝組學研究中確定的衰老的基本生物標志物。
　　
　　Chaleckis等使用液相色譜和質譜方法將年輕人隊列中采集的血液樣本與老年人的樣本進行了比較。在這項研究中，總共檢測到126種代謝物，每個個體的每種化合物都測量了一個變異系數。結果表明，血液中發現的14種代謝物隨年齡的增長而顯著變化(增加或減少)：1，5-脫水葡萄糖醇、二甲基鳥苷、乙酰肌肽、肌肽、鄰苯二甲酸、UDP-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰精氨酸、N6-乙酰賴氨酸、泛酸、瓜氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、NAD+和NADP+。然而，在眾多研究中，這些并不是唯一的代謝組學衰老生物標志物。
　　
　　脂類代謝也在衰老過程中受損，因此脂質體的不同部分會隨著年齡的增長而改變水平。甘油三酯的水平隨著年齡的增長而增加，因此這一組分可以被認為是衰老的生物標記物。根據Mata分析，膽固醇(總)、低/高密度膽固醇(脂蛋白)也是發病率和死亡率的預測因子，而磷脂和鞘脂被認為是健康衰老的標志。
　　
　　還有，蛋白質代謝中有許多產物可以作為衰老的生物標志物。氨基化蛋白質的積累是多肽非酶翻譯后修飾的結果，主要是蛋白質的N末端被修飾，也發生在含有Lys或Arg的側鏈上。尿素分解產生的異氰酸與蛋白質和多肽的N-末端和側鏈反應。在這種情況下，最優先的目標是基質蛋白，如I型膠原和彈性蛋白，具有較長的半衰期。在衰老的背景下，晚期糖基化終產物(AGEs)成為一個當前的問題；蛋白質、脂質和核酸通常在高糖溶液暴露期間糖基化，這個過程發生在沒有酶存在的情況下，它們的積累導致炎癥和細胞凋亡，并表明在與年齡相關的肥胖以及糖尿病。
　　
　　不同的代謝反應都有副產物，往往環境影響導致氧化應激，因此氧化損傷標志物在生物體中廣泛分布，其數量通常隨著年齡的增長而增加，因為氧化應激是衰老的原因和結果，因此此類化合物恰好適合于衰老生物標志物的檢測。例如，3-硝基酪氨酸、3-氯酪氨酸和鄰酪氨酸等化合物與衰老過程中的蛋白質損傷密切相關。丙二醛、4-羥基-反己烯醛、4-羥基-反式壬烯醛、8-異前列腺素F2α和醛C6-C12通常被用作衰老過程中脂質氧化損傷的生物標志物。8-羥基-2-脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷等化合物是DNA在促氧化劑處理和氧化應激源暴露下損傷時出現的，因此這些殘留物可以作為衰老相關氧化損傷的指示物。
　　
　　5. 衰老的細胞生物標志物

　　為了將衰老的細胞生物標記物系統化，我們將它們分成以衰老標志命名的類別。它們是線粒體功能障礙的標志物、細胞間通訊失調的標志物、細胞衰老和蛋白穩定性喪失的標志物。衰老的細胞標志物多為細胞或細胞器和細胞群體形成的表型。
　　
　　線粒體過氧化氫的產生是最早的生物標志物之一，它是通過使用α-甘油磷酸酯作為底物的熒光檢測試驗來測量的。LON蛋白酶活性降低，烏頭酸酶周轉率隨年齡顯著變化，它們共同表明線粒體功能障礙。老年骨骼肌線粒體主導酶(檸檬酸合成酶)水平降低，線粒體氧化磷酸化能力隨年齡增長而降低，線粒體ATP的產生也隨之降低，我們在上面已經提到，老年個體細胞中線粒體DNA和RNA的含量較低。
　　
　　循環中的細胞成分、細胞器、自由基、過氧化脂質、各種代謝物，如細胞外ATP、神經酰胺、尿酸鹽結石、琥珀酸、淀粉樣蛋白等都與細胞間通訊有關，因為特定的感應器分子可以識別它們，從而誘導對細胞應激的反應。此外，可能是熱休克蛋白、S100、高遷移率族蛋白1或組蛋白的DAMP是衰老的候選生物標志物，表明細胞死亡和免疫反應。
　　
　　NLRP3，也被稱為炎癥小體，激活Pro-Caspase-1，然后釋放IL-1β和IL-18(致炎細胞因子)。我們的天然免疫主要針對它們的成分，因此心磷脂作為一種抗原(以及其他類似病原體的化合物)可以促進內源性炎癥和免疫反應，這種反應主要由Nlrp3和其他感應器或下游級聯元件激活的各種信號分子所代表。
　　
　　C-反應蛋白、白細胞介素-6和α1-抗糜蛋白酶與大腦加速老化和認知衰退有關。對內源性致病基因類分子的促炎反應并不是促進細胞衰老的唯一變體。它還與產生衰老相關分泌表型(SASP)的衰老細胞相連。趨化因子、生長因子、腫瘤壞死因子-α、IGF結合蛋白、基質金屬蛋白酶、單核細胞趨化蛋白-1和已經提到的IL-6的增加在與慢性炎癥(炎癥)和細胞衰老相關的衰老中可以觀察到。
　　
　　在有絲分裂活性高的組織中，衰老細胞的數量反映了細胞衰老的過程，有幾種細胞衰老的生物標志物。蛋白β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)活性升高、p16INK4A表達增強和Rb低磷孢子擴散是細胞衰老的最典型的生物標志物，在受試細胞中有兩種內表型：細胞周期停滯、對有絲分裂原的抗性和致癌轉化。這些特征是可以測量的，并且適合作為與細胞衰老有關的衰老過程的生物標志物。
　　
　　細胞間蛋白平衡由三個基本系統組成：泛素蛋白酶體系統、自噬小體和伴侶分子。第一個系統參與蛋白質降解，第三個系統輔助蛋白質折疊，增強其穩定性。有幾個過程可以作為蛋白穩定性評估的指標，人們可以將這些過程的數量特征用作衰老的特定生物標記物。我們列舉了與年齡相關的蛋白穩定性喪失的主要過程：伴侶蛋白耗竭增加，細胞內蛋白質聚集和聚集體出現，大自噬功能受損，其活性降低，受體識別、吞噬誘導和APG-Lys融合也減少。已知在老年生物體中伴侶介導的自噬和L2A水平降低。同樣的說法對于UPS活性、泛素化和亞單位水平的組裝也是正確的，這些標記物是減少的，因此所有上述被測量的過程都可以作為老化的生物標記物。
　　
　　總  結
　　
　　總體而言，衰老的生物標志物分寸豐富，它們在精確度和可靠性以及可重復性方面差異很大，通常不可能挑選出最好的生物標志物，因為只有描述衰老過程的一組生物標志物(不僅是細胞和分子的)才可能真正提供信息。
　　
　　準確地說，“越多越好”是該領域的主導原則。在當前和未來預測醫學和個性化醫學的背景下，我們必須確定可靠的標記物，研究好衰老標記物的檢測標準，才能使個體衰老軌跡的準確預測成為現實。

　　參考文獻：
　　
　　1. https://www.afar.org
　　
　　2. https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-030-24970-0
　　
　　合作作者簡介
　　
　　于淼英博士，中國農業科學研究院博士后，長期從事動物胚胎干細胞研究，目前為上饒師范學院副教授，主持國家自然科學基金項目、江西省自然科學基金項目。